Selekční tlak selektivních kultivačních médií
Další vlastností mnoha kultivačních médií, je jejich selektivita. Tedy vlastnost kultivačního média potlačit růst některých skupin bakterií, takže tam naopak rostou pouze bakterie určitých druhů. Tudíž máme selektivní pole G+, G-, Stafylokoké pole, pole pro Streptokoky, speciální pole pro Stap. Aureus, pro vysoce rezistentní bakterie, nebo pro kvasinky. Tolik teorie, praxe je však zcela jiná. Takže všichni víme, že na selektivím agaru pro stafylokoky mohou růst i Corynebacteria, Aerococcus, sem tam Lactococcus a mnoho dalších bakterií. Podobně je tomu na selektivní půdě pro streptokoky a úplně jistá není ani selektivita G- agaru. A je vždy na jednotlivých výrobcích médií, jak moc mají půdy „vyladěné“. Ať tak nebo tak, tato selektivita není „zadarmo“. Fakticky je opět způsobena přidáním dalších chemikálií (může jít i o kuchyňskou sůl), nebo specifických antibiotik do existujících agarů. To potlačí růst nežádoucích bakterií, ale krom toho takto nepřátelské prostředí do jisté míry neprospívá ani bakteriím o které máme zájem. A selektivní médium, se tak stává více nepřesné.
Obr. č.1: Streptococcus uberis – různá bakteriální nálož a vzhled kolonií ve vzorcích, při stejném provedení (na médiu DCFC) :
Co je to vlastně bakteriální kolonie?
Není pravda, že jedna bakterie vytvoří jednu kolonii. Kolonii založí vždy určitý počet mikroorganizmů, které dohromady vykazují životaschopnost, označuje se to jako „kolonie tvořící jednotky“ (CFU). A záleží tedy na tom kolik CFU naneseme kličkou na kultivační médium. Takže čistě teoreticky pro názornost například na neselektivním krevním médiu stačí na vytvoření kolonie 100 bakterií stafylokoka (jedna CFU). Pokud naneseme stejný vzorek na selektivní G- agar, neporoste tam nic, neb prostředí nepodporuje růst stafylokoků. Pokud dáme stejný vzorek na selektivní agar pro stafylokoky, měl by nám ze vzorku „vytáhnout“ (tedy umožnit růst) v ideálním případě pouze stafylokokům, nicméně na vytvoření jedné kolonie už vlivem toxicity prostředí nebude stačit 100 bakteriálních buněk, ale například 300.
V praxi to ale znamená, že na selektivním agaru vyroste méně kolonií než na neselektivní půdě (obr.2). Při hodnocení tedy toto musíme vzít v potaz. To znamená, že máme-li specifického patogena jako například S.aureus, nebo S.uberis, již jedna kolonie na selektivním agaru je vysoce pozitivní výsledek. A v krajním případě, pokud je bakteriální nálož velmi malá (tedy zvíře je pozitivní, ale aktuálně vylučuje málo bakterií) nevyroste nic. A dostáváme falešně negativní výsledek.
Všichni známe případy, kdy zvíře má zvýšené somatické buňky (SCC), nebo dokonce vykazuje klinické příznaky, ale kultivace vychází negativně. Příčiny mohou být různé, ale jeden z nich může být i tento princip selektivity. Tím se znovu vracím na začátek kapitoly, kde je popisována užitečnost krevního pole na diagnostické misce jako jedna z vrstev kontroly v principiálně nepřesném systému – tam by mělo růst vše co se ve vzorku vyskytuje a jelikož bakterie nikde nechodí sama, tak pokud tam nějaká je, je v dostatečném počtu na to aby vytvořila alespoň jednu kolonii, na rozdíl od selektivního agaru. A tedy kontrola spočívá v tom, že pokud v případě monokultury na selektivním agaru nic neroste, ale na krevním agaru několik kolonií je, zvíře je pozitivní.
V systému selektivního zaprahování, v případě patogenů jako S.uberis, nebo Staph. aureus je to zcela zásadní informace. Protože nepoužijeme-li u takového zvířete antibiotika v domnění že je negativní, tak důsledky poznáme záhy po porodu…..
Základní principy faremní kultivace
Obr. č.2: Zcela vlevo je chromogenní neselektivní B3 kultivační médium, používané pro faremní diagnostiku. Toto médium dává uživateli možnost rozdělení plotny dle potřeby, takže zde jsou nakultivovány dva vzorky – nahoře kráva 203 a dole 304, v tomto případě je jedno zda se jedná o směsný, nebo čtvrťový vzorek.
Vzorek číslo 203 je subklinický zánět na němž se podílí dva patogeny a sice Staph. chromogenes (označený na obrázku) a Serratia (na obrázku neoznačena – ale jsou to ty tmavohnědé kolonie) tyto bakterie jsou svým počtem dominantní, ale ve vzorku jsou přítomny sporadicky ještě i další stafylokoky a možná ještě sporadičtěji i jiné bakterie. Tato kultivace je standartně 24 h. Stejný vzorek se nanesl i na selektivní chromogenní DCFC médium (uprostřed) a zde je vidět, jak selektivní půda sice vzorek „pročistila“ od ostatních bakterií, ale rovněž zredukovala počty kolonií hlavních patogenů jak v případě Staph. chromogenes, tak v případě Serratia. A nutno dodat, že DCFC půda je v porovnání s jinými stále ještě velmi citlivá. Tento vzorek byl kultivován dalších 24 hodin (obrázek vpravo nahoře), kde můžeme vidět že počet kolonií hlavních patogenů se nezměnil, ale poněkud nesměle se tam objevily i kolonie dalších bakterií z původního vzorku.
Vzorek 203 by též mohl být, podle výsledku z B3 považován za kontaminovaný, nebo hyperkeratózní. Sice nemá krevní pole abychom to ověřili, ale vzhledem k jeho citlivosti a prostředí ve kterém se nabírá a zpracovává, je míra kontaminace standartní. Což potvrdilo selektivní médium. Z čehož tedy vyplývá, že při hodnocení výsledků by měl být uživatel seznámen s tím co používá a jak to používat. Pro pořádek nutno dodat, že i na B3 je možné vykultivovat zcela čistou monokulturu a ke kontaminaci nedochází vždy.
Pro úplnost zde popíšeme ještě i obrázek 304, kde není specifický nález a jednalo se o hyperkeratózní struk. Vlevo a B3 jsou vidět 3 kolonie Staph. sciuri ale uprostřed dole na selektivním médiu DCFC už jen jedna a to je pole kde rostou všechna G+. Na specifickém selektivním poli pro stafylokoky („mléčný“ agar) neroste nic.
Pokud by to byl test před záprahem, vyjde vám tedy na selektivním médiu v zásadě negativní výsledek a většina uživatelů by jej tak odečetla. Krávu by zaprahla neantibioticky. Nicméně tím by udělali naprosto zásadní chybu, jejíž důsledky by opět poznali záhy po porodu. SDCT opravdu není úplně triviální záležitost.
Tuto nejistotu můžeme do značné míry obejít tím, že kultivaci zopakujeme za 2 až 3 dny. Což je samozřejmě možné pouze v případě subklinických zánětů.
A dále platí samozřejmě obecné doporučení, že pokud na médiu za 24 hodin nic nenaroste je třeba kultivovat déle, neb některé patogeny „rostou“ pomaleji typicky Trueperella, Corynebacterium a další.
V tomto kontextu je třeba zmínit zajímavou bakterii Gordoniia paraffinivorans (obr. 3) která byla zatím zjištěna jako původce mastitid pouze v našem regionu. Způsobuje lehké klinické záněty, ale vykazuje velikou variabilitu co se antibiotické citlivosti týká a vyroste skutečně až po dvou dnech kultivace. Tedy další možnost falešně negativního výsledku, při nedůsledné práci. Nicméně jak vyplývá z obr. 3 tak při prodloužené kultivaci obvykle vyrostou na selektivním médiu i další nepatogenní bakterie a je nutné to při hodnocení vzít v potaz. Pro tyto bakterie, je sice nastavené prostředí nepřátelské, ale růst je potlačen tím, že přidané látky pouze zpomalí generační cyklus, ale množení nezastaví. Jinými slovy bakterie, které by vytvořili kolonii za 24 hodin ji vytvoří až za 48 hodin. A to je při odečítání prodloužené kultivace opět třeba vzít v potaz.
Obr.č.3: Gordoniia paraffinivorans
Takže nyní jsme si řekli jakým způsobem uvažovat při rozhodování o způsobu zaprahnutí (případně léčbě), když je ve vzorku bakterií málo, ale často bývá i opačná situace, že je ve vzorku bakterií mnoho. To jakým způsobem se bude hodnotit vzorek, zase zaleží na tom, jaký typ média jsme použili a zda na misce máme kontrolní krevní pole či nikoli. Obecně se literatura shoduje na tom, že mastitida může být způsobena nanejvýš dvěma rozdílným bakteriemi. My se sice domníváme že to nemusí být až tak úplně pravda, ale zatím s tím pracujme jako s faktem. Tyto původci by měli na médiu narůstat jako monokultury. Viz obr. 4
Obr.č.4: ukazuje smíšenou infekci, Klebsielly a St.uberis. Vzorek je velmi hezky udělán a odečtení nečiní žádný problém
Ale opět – použijeme -li selektivní půdy, je nutné pamatovat na to, že skutečná bakteriální nálož bude o něco vyšší.
Pokud na médiu narůstá směs bakterií, ale žádná nemá výraznou „převahu“ (obr. č. 3) pak jsou dvě možnosti – buď byl vzorek při odběru kontaminován, nebo je ve struku nějaký stupeň hyperkeratózy strukový svěrač „netěsní“ a bakterie volně pronikají dovnitř a množí se tam. Bez kontrolního krevního pole se to nepozná a buď musíte udělat kultivaci znova, nebo velmi pečlivě zkontrolovat zvíře. Na zmíněném obrázku (obr.3) ale kontaminace není a nález je způsoben právě hyperkeratózou 1. stupně. Taková kráva bude mít již navždy zvýšený počet somatických buněk. Z pohledu léčby se pak zvíře vyhodnotí jako negativní.
Pokud se ale použijí citlivá média, tedy obecně neselektivní agar, je situace poněkud odlišná. Narostou tam sice opravdu všechny patogeny a jejich denzita odpovídá bakteriální náloži, ale obvykle tam narůstají i jiné bakterie, které jsou zpravidla kontaminanty přímo vzorku, anebo se na misku dostávají v průběhu nanesení. Jak bylo uvedeno již v úvodu, tak faremní kultivace je z principu nepřesná a to mimo jiné také proto, že ve stáji není možné udržet potřebný stupeň sterility jako v profesionální laboratoři. Dalo by se dokonce říci, že je jen málo tak mikrobiologicky znečištěných míst.
Jelikož je téma selektivního zaprahování více než aktuální, vznikl proto na jaře letošního roku cyklus seminářů na téma Produkce a reprodukce – dva základní pilíře úspěchu ve stáji a zároveň zásadní výzvy na mléčné farmě pořádaný Zemědělským Svazem České republiky. Zásadní body ze semináře týkající se produkce představíme v několika následujících příspěvcích.
MVDr. Petr Slavík, Ph.D.
www.agropress.cz
